结核病研究与发展

　　1.概述

　　2019年没有新技术出现，正在开发的技术主要是基于分子的，并且与适合在治疗点使用的诊断方法的开发还存在很大差距。迫切需要新技术，以尽量减少对结核病患者及时诊断的障碍，确保对难以诊断的人群进行有质量保证的诊断，扩大药物敏感性检测（DST）的范围，并降低诊断平台及其维护的成本。

　　结核病诊断进展概述，2019年8月

　　发展中的技术

　　检测TB和耐药的分子生物学技术

　　n Gendrive MTB/RIF ID, Epistem, UK

　　n Xpert XDR-TB cartridge, Cepheid, USA

　　n TruArray MDR-TB, Akkoni, USA

　　n INFINITIMTB Assay, AutoGenomics, USA

　　n FluoroType XDR-TB assay, Hain Lifescience, Germany

　　n MeltPro TB assay, Zeesan Biotech, China

　　n QuantuMDx, POC, UK

　　潜伏感染检测技术

　　n Diaskin test, Generium, Russian Federation

　　市场上可获得（未有经世卫组织评估的证据）

　　n C-Tb test, Serum Institute of India, India

　　检测TB和耐药的分子生物学技术

　　n iCubate System, iCubate, USA

　　n Genechip, TB drug resistance array, Capital Bio, China

　　n EasyNAT TB Diagnostic kit, Ustar Biotechnologies, China

　　WHO推荐的技术

　　检测TB和耐药的分子生物学技术

　　n Xpert MTB/RIF and Xpert Ultra as the initial diagnostic test for TB and rifampicin resistance, Cepheid, USA

　　n Line probe assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis (MTB), isoniazid and rifampicin resistance in  acid-fast  bacilli smear positive sputum or MTB cultures (FL-LPA), Hain Lifescience,

　　Germany and Nipro, Japan

　　n Line probe assays for the detection of resistance to fluoroquinolones and second-line injectable agents (SL-LPA), Hain Lifescience, Germany

　　n TB LAMP for detection of TB, Eiken, Japan

　　非分子生物学技术

　　n Inteferon gamma release assay (IGRAs) for the diagnosis of latent TB infection (LTBI) Oxford Immunotec, UK; Qiagen, USA

　　培养为基础的技术

　　n Commercial liquid culture systems and rapid speciation

　　n Culture-based phenotypic DST using 1% critical proportion in

　　LJ,7H10,7H11 and MGIT media.

　　涂片镜检

　　n Light and light-emitting diode microscopy (diagnosis and treatment

　　monitoring)

　　生物标志物为基础的技术

　　n Alere Determine TB-LAM, Alere, USA (TB detection in people seri- ously ill with HIV)

　　世卫组织计划于2019/2020年进行评估的技术

　　检测TB和耐药的分子生物学技术

　　n Molecular technologies for genotypic drug resistance testing (including sequencing technologies)

　　n FluoroType MTBDR, Hain Lifescience, Germany

　　n m2000 RealTime MTB System, Abbott, USA

　　n BD Max MDR-TB, Becton Dickinson, USA

　　n Roche cobas？ MTB system, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland

　　培养为基础的药敏试验

　　n SensititreTM MYCOTBI plate; ThermoFisher Scientific Inc., USA

　　2.世卫组织于2019年评估或计划于下一年评估的结核病诊断检测产品和方法

　　侧流阿拉伯甘露聚糖分析

　　自2015年以来，世卫组织已建议根据尿液中的细菌脂环素阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原进行检测，以协助重症HIV感染者的结核病诊断。由于敏感性欠佳，尿液LAM分析不适合用作结核病的常规筛查。

　　但是，与传统的诊断方法相比，它们已显示出合并感染HIV的TB病例诊断的高敏感性，尤其是CD4计数低的患者。

　　2019年5月，世卫组织对使用侧向流动LAM分析（LF-LAM）（Alere）诊断TB/HIV进行了系统综述，并召集了一个指南制定小组以更新在2015年WHO发布的指南。与2015年指南的主要变化是在有结核病指征和症状（肺部和肺外）的住院HIV阳性患者中加强使用LF-LAM，现在建议对所有此类患者进行测试，无论其CD4计数如何。如果CD4计数低于100，即使没有结核病症状，也建议使用LF-LAM。更新的WHO指南在2019年底发布。

　　集中化高通量检测平台

　　2019年7月，世卫组织召集了一个技术小组来评估4个基于聚合酶链反应（PCR）的集中化测试平台的性能，这些平台适用于高通量实验室。平台包括RealTime MTB（雅培，美国伊利诺伊州芝加哥的阿伯特市，美国），罗氏Cobas MTB分析（罗氏，巴塞尔，瑞士），FluoroType MTBDR测试（Hain Lifescience，Nehren，德国）和Max MDR-TB测试（Becton Dickinson，新泽西州，美国）。

　　每个平台都进行了比较分析性评估。一组特征非常明确的菌株用于测试其在检测结核分枝杆菌、对异烟肼和利福平耐药的敏感性。一组特征明确的抗结核分枝杆菌菌株（如培养分离株）被用来测试其检测利福平和异烟肼相关关键突变位点的能力。技术专家组一致认为，在第一个测试阶段中，所有4个平台的性能都足够好，可以进入第二个评估阶段。然而，由于这些新检测方法使用多拷贝或新的DNA靶标（或两者）检测结核病，因此需要进行更多的研究以验证新方法的特异性。

　　第二阶段将测试这些方法的临床有效性。这将需要在2个或3个结核病高负担环境下的国家参比实验室进行，并将结果与参考标准如培养，表型DST和分子测序以及Xpert？MTB / RIF进行比较。

　　鼓励国家结核病防治规划（NTP）为这些平台的性能提供进一步的证据，尤其是在已经有仪器用于检测HIV或HCV病毒载量的地方。

　　世卫组织还鼓励在规划条件下使用和进一步评估这些集中化高通量测试平台，以帮助产生更多可用于制定关于这些平台使用的政策指南提供的证据。如果有足够的新证据可用，世卫组织可在2020年初重新评估这些平台的性能。

　　快速检测结核病和耐药性的方法

　　在细菌数量少的标本中，Xpert MTB / RIF Ultra（Ultra）技术在检测结核分枝杆菌的灵敏度方面，其性能明显优于当前的Xpert MTB / RIF试剂。尤其是在涂片阴性培养阳性的标本（例如来自艾滋病毒感染者的标本），肺外标本（尤其是脑脊液）和儿童标本。

　　但是，与金标准液体培养法相比，由于担心其在HIV阴性成年人中的特异性（假阳性结果），转为使用二代试剂盒受到了限制。南非是当前唯一使用Ultra作为结核病初始诊断测试的唯一结核病高负担国家，用于诊断成人和儿童肺结核和肺外结核的Ultra性能的最新系统综述将用于支持2019年12月世卫组织关于使用Ultra的政策指南的完善和更新。

　　Cepheid接近即时检测的平台GeneXpert？Omni？（Omni）正在取得进展。该平台正在进行现场评估，以评价其与GeneXpert仪器的生物等效性。如果证明具有等效性，其将首先使用二代Xpert Ultra盒用于结核病和利福平耐药（RR-TB）的检测。1Omni有望与现有的多模块GeneXpert仪器配合使用，包括GeneXpertEdge？（与平板电脑设备相连的用于传输数据的单模块GeneXpert仪器，其特点包括一个辅助电池，该电池确保仪器可在更基层的地方操作，与显微镜镜检级别相同）。Omni和Edge的开发均旨在促进更广泛地获得针对结核病和利福平耐药性的快速分子检测方法，以及HIV和HCV的病毒学参数。

　　Cepheid也在开发一种试剂，以检测对异烟肼，氟喹诺酮和丁胺卡那霉素的耐药性。到2020年，可能有足够的数据用于世界卫生组织评估。

　　Truenat MTBassays？（印度班加罗尔的Molbio Diagnostics）是GeneXpert平台的替代产品，该平台开发用于基层初级保健机构。

　　有两种基于卡式试剂盒的检测方法：一种用于结核病检测，另一种用于检测任何阳性样本的利福平耐药性（反射）。 创新诊断基金会（FIND）正在埃塞俄比亚，印度，巴布亚新几内亚和秘鲁的基层显微镜检查中心对这些检测的诊断准确性进行多中心研究。于2019年11月得出结果，并在2019年12月通知世卫组织审查。

　　计算机辅助检测系统

　　胸部放射线照相或胸部X射线（CXR）是结核病分类和筛查的重要工具，对于诊断结核病非常有帮助。 CXR的主要局限性在于它需要经验丰富的读片人员（通常是放射科医生或技术人员）来解读图像。即使在受过训练的人员之间的差异也是常见的，这进一步影响了CXR的准确性。在许多国家，很少有经验丰富的CXR读片人员。WHO的最近指南是2016年发布的。

　　近年来，已经开发了使用数字技术检测包括结核病在内的生理和病理状况的计算机辅助检测（CAD）系统。这些CAD系统结合了计算机算法，可以分析数字CXR并生成标准化的结果解释。通过生成分数或报告，以评估CXR图像与TB一致的可能性。CAD系统的培训是通过使用机器学习技术学习数千幅图像。

　　迄今为止，世界卫生组织还无法提供任何关于将CAD用于结核病的积极建议。2016年发表的对5篇同行评审文章的系统综述结论显示：其诊断准确性的证据目前是有限的，主要因为仅有少量的针对唯一的市售CAD软件的研究。FIND当前正在建立数字CXR的存档，可用于评估市售CAD解决方案的性能。如果有足够的数据可用，世卫组织计划在2020年初评估使用CAD系统检测结核的情况。

　　微孔板稀释DST方法

　　牛津大学主办的“结核病综合耐药性预测：一个国际联合会（CRyPTIC）”已生成了约8万株具地理和遗传多样性的菌株的基因型和表型数据库。使用ThermoFisher微孔稀释板方法检测表型结果，与商业BACTEC分枝杆菌生长指示管（MGIT）液体培养系统相比，这是一种低成本的DST方法。世卫组织计划在2020年上半年评估微孔板稀释方法，以作为金标准方法（即MGIT）的替代方法。

　　用于DST的抗结核药物的临界浓度

　　基于培养的表型药敏是目前检测抗结核药物耐药性的参考方法，它依赖于药物的临界浓度，即抑制99％的表型野生型结核分枝杆菌菌株在体外生长的最低浓度。

　　2018年，世卫组织出版了一份关于在耐药结核病治疗中使用的特定药物的药敏试验操作的技术手册。该手册提供了二线抗结核药物药敏试验的操作程序，包括较新的药物（贝达喹啉和德拉玛尼）和改用的药物（氯法齐明和利奈唑胺）。

　　越来越多的证据表明，过去在固体培养基中建立的用于测试对异烟肼和利福霉素（利福布汀，利福平和利福喷丁）耐药性的关键浓度不一定适用于商业液体培养系统。世卫组织已委托FIND对表型上的野生型和非野生型菌株的最低抑菌浓度的现有数据进行系统评价。 2020年，此次系统评价的结果将用于评估是否应修订当前推荐的相关临界浓度。

　　3.潜伏性结核感染测试

　　当前，有两种方法可以检测结核潜伏感染：Mantoux结核菌素皮肤试验（TST）和γ干扰素（IFN）释放试验（IGRA）。 两者都是依赖于细胞介导的免疫力（记忆性T细胞反应）的测试，但都无法准确地区分结核感染和活动性结核病。

　　TST

　　TST通常使用Mantoux技术进行，该技术包括皮内注射2个结核菌素单位（TU）的RT-23或5个结核菌素单位的纯化蛋白衍生物（PPD-S），结果报告为硬结的横向直径。但是，PPD TST的特异性相对较低，对免疫抑制的个体（例如，HIV感染者）缺乏敏感性，并且需要两次就诊（一次进行检查，一次进行结果读取）。 另一个挑战是，如果未能在48-72小时内到门诊评估结果，此次测试将无效。

　　IGRA

　　IGRA有两种方法：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的全血方法和基于酶联免疫吸附斑点（ELIS-POT）的测定。 ELISA全血测试以试管形式使用来自RD1的ESAT-6和CFP-10的抗原肽，以及非RD1抗原的另一种抗原肽。结果报告为每毫升含有IFN-γ进行定量（国际单位，IU）。

　　ELISPOT是基于分离并计数的外周血单核细胞（PBMC）进行的，其与ESAT-6和CFP-10肽一起孵育。结果报告为产生IFN-γ的T细胞（斑点形成细胞）的数量。与TST相比，IGRA不受卡介苗（BCG）疫苗接种状况的影响，因此可用于评估接种BCG疫苗的个体的潜伏性结核感染，尤其是在婴儿出生后接种BCG疫苗或复种疫苗的国家。但是，IGRA平台的运行成本更高，需要专门的试剂盒、合格的技术人员和经过认证的实验室。

　　其他检测方法

　　更新的基于皮肤的感染检测方法开始出现。这些测试旨在最大程度地利用当前实施平台的优势，并有可能提高对潜伏感染的诊断和治疗的纳入。它们包括C-Tb（Staten Serum Institut）和Diaskin测试（Generium）。 这两者都包含源自结核分枝杆菌的重组ESAT-6（二聚体）和CFP-10（单体）抗原，可以提供比TST更好的性能（特别是在特异性方面）。它们还可以为现有的IGRA测试提供一项准确的可接受且更低成本的替代方案。与IGRA相比，新出现的证据表明这两种检测方法具有相似的特异性，且在儿童和HIV感染人群中提供与成人相似的结果。

　　QuantiFER-ON-TB Gold Plus的制造商Qiagen开发了该测试的简化版本，该测试在单个试管中将抗原整合，并使用了侧向流检测系统，这有可能提供比当前IGRA更简单的替代检测系统。

　　4.扩展应用DNA测序技术以诊断耐药结核病

　　传统上，在结核病实验室中，结核分枝杆菌菌株耐药性的诊断非常依赖基于液体或固体培养的DST。然而，表型药敏结果在孵育数周至数月后才能获得，而且基于培养的方法需要建立严格的生物安全实验室也是一项挑战。由于结核分枝杆菌复合群的耐药性主要是通过细菌基因组中特定基因靶点的点突变引起的，因此越来越多地使用分子检测来进行更快速的检测，从而更早地开始对耐药结核病的适当治疗。与目前的快速分子检测相比，DNA测序可以提供有关多个基因区域耐药性的详细信息。认识到下一代测序可提供的附加价值，世卫组织已发布了测序在检测结核分枝杆菌复合群耐药相关突变作用的指南。世卫组织还建立了一个结核病测序数据库，该数据库将基因型、表型DST数据与耐药结核病的源数据进行整合、标准化和统一。该数据库被认为是连续收集和解释测序、表型和临床结果数据的“活”平台。在FIND的支持下，正在开展其他工作以扩展其功能，从而为开发新的TB药物和治疗方案以及开发和验证新型分子诊断工具提供信息。

                                                                                                                                                                                      (来源：中国疾控中心结核病预防控制中心网站)